Презентация на тему "Методы редактирования генома"

Содержание

• 
  Слайд 1

  Методы редактирования генома

  Mouravlev A., PhD, Research Fellow, Centre for Brain Research, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, Auckland, New Zealand

• 
  Слайд 2

  Редактированиегенома

  Набор молекулярно-биологических методов по направленной модификации (делеции, вставки, точечные замены) геномной ДНК с использованием искусственных высокоспецифичных сайт-направленных нуклеаз (молекулярных ножниц). Genome Editing with Engineered Nucleases (GEEN) Недостатки предшествующих технологий: Ограниченный круг организмов (гомологичная рекомбинация у дрожжей или “recombineering” (recombination-mediated genetic engineering)у мышей), Необходимость использования селективных маркеров (антибиотиков), Наличие остаточных последовательностей ДНК(loxPsites from Crerecombinase-mediated excision).

• 
  Слайд 3
  

  Два основных внутриклеточных пути репарации разрывов геномной ДНК:1. Non-Homologous End Joining (NHEJ) 2. Homology Directed Repair (HDR) or Homologous Recombination (HR)Присутствуют практически во всех типах клеток и организмов

  NHEJ - образованиe вставок или делеций различной случайной длины (insertion/deletion mutations - indels) , которые могут нарушать трансляцию белков за счет сдвига рамки считывания или блокировать связывание транс-активаторов с промоторами или энхансерами. HDR - введение точечных мутаций, встройка протяженных участков ДНК. Частота событий от 1% до 50% - отбор без селективных маркеров.

• 
  Слайд 4
  

  4 типа или семейства искусственныхсайт-направленныхнуклеаз: 1. Meganucleases (re-engineered homing endonucleases) 2. ZFNs (Zinc Finger Nucleases) 3. TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) 4. CRISPR/Cas System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 Nuclease)

• 
  Слайд 5

  Мегануклеазы

  Мегануклеазы - искусственно сконструированные варианты природных эндонуклеазрестрикции, хоминг нуклеаз (homing nuclease), спротяженными сайтамиузнавания от 14 до 40 пн. "Эгоистичные" белки – обеспечивают перемещение собственного нуклеазного гена и фланкирующих его последовательностей по геному. Впервые обнаружены в 1990-х годах. Известно несколько сотен мегануклеаз с различными сайтами узнавания длиной до 40 пн. Последовательности узнавания вырождены. Основной способ получения новых искусственных нуклеаз - введение аминокислотных замен в сайты узнавания с последующим анализом и отбором. Основной недостаток - ограниченность набора сайтов узнавания и большая трудоемкость получения новых нуклеаз с заданной специфичностью.

• 
  Слайд 6

  Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

  Цинковый палец - небольшой домен в составе ДНК-связывающих белков (около 20 аминокислотных остатков), содержащий ионы цинка. Часто встречается в составе транскрипционных факторов, обеспечивая их специфическоесвязывание с промоторами. В зависимости от аминокислотного состава цинковые пальцы могут распознавать и связываться с различными фрагментами ДНК длиной от 3-х до 6-ти нп. В состав ДНК-связывающего домена (DNA BindingDomain, DBD) входит более 3-х цинковых пальцев. ZFNs получают слиянием ДНК-связывающего домена (DNA BindingDomain, DBD), образованного набором цинковых пальцев определенной специфичности, с ДНК-разрезающим центром какой либо рестриктазы, обычноFokI. Новые ZFNsжелаемой специфичности конструируют путем различной комбинации цинковых пальцев, распознающих 3 пн. В свою очередь, цинковые пальцы с новой специфичностью получают, используя технологии фагового дисплея, one- or two-hybridsystemв дрожжах и бактериях.

• 
  Слайд 7
  

  Выбор рестриктазыIISтипа (FokI) обусловлен тем, что онаразрезает ДНК вне сайта узнавания. Расщепляющие домены FokIдолжны образовывать димеры, поэтому для получения двухцепочечного разрыва ДНК необходима пара ZFN, сайты связывания которых разнесены на оптимальное расстояние в 5-7 пн.

• 
  Слайд 8

  TALE - transcription activator-like effector

  TAL эффекторы - ДНК связывающие белки, встречающиеся в некоторых патогенных бактериях растений, которые способны направленно связываться с промоторами хозяйских генов и регулировать их экспрессию в предпочтительном для себя направлении, повышаякак инфекционность, так и последующую пролиферацию и диссеминациюэтихпатогенов. Центральная область белка представлена тандемными повторами, каждый из которых связывается с единичным нуклеотидом в сайте узнавания ДНК. Количество повторов - от 1,5 до 35,5 (последний повтор укорочен). Каждый повтор состоит из 33-35 аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки в положениях 12 и 13 высоковариабельны и определяют нуклеотид связывания.

• 
  Слайд 9

  TALEN - transcription activator-like effector nuclease.

  Эффекторный домен природного ТАЛЕ - небольшой пептид, способный взаимодействовать с компонентами транскрипционного комплекса, обеспечивая либо его активацию, либо репрессию. По аналогии с ZFNдля целей редактирования генома эффекторныйдомен TALEможет быть заменен ДНК-разрезающим центром рестриктазыFokI, с образованием TALEN (transcription activator-like effector nuclease). Наличие простого, не зависящего от окружающего контекстакода между аминокислотной последовательностью повтора и единичным нуклеотидом связывания дает возможность конструирования TALEN с любым сайтом связывания. Ограничение - необходимость иметь нуклеотид Т перед сайтом связывания. На практики это не создает особых проблем. Более серьезная проблема - конструирование и синтез кодирующих TALEфрагментов ДНК, содержащих многочисленные повторы.

• 
  Слайд 10
  

  A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator–like effector genes. Schmid-Burgket al., Nat Biotechnol. 2013 Jan;31(1):76-81.

• 
  Слайд 11
  

  CRISPR/Cas System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 Nuclease)

  Система CRISPR/Casявляется адаптивным иммунным механизмом архей и бактерий, защищающий их от чужеродных генетических элементов, таких как ДНК фагов или плазмид. Деградация чужеродной ДНК осуществляется с помощью эндонуклеазCas (CRISPR-associated), однако ее распознавание происходит на уровне РНК/ДНК-ового взаимодействия. В качестве распознающих элементов выступают короткие эндогенные РНК, комплементарные участкам чужеродной ДНК, в комплексе с нуклеазамиCas. Первые эксперименты по редактированию генома с помощью системы CRISPR/Cas9были осуществлены в 2012 году.

• 
  Слайд 12
  
• 
  Слайд 13

  Различные варианты использования системы CRISPR/Cas9

• 
  Слайд 14
  
• 
  Слайд 15

  Практические приложения техники редактирования генома

• 
  Слайд 16

  Иммуноглобулины Y, IgY

  Иммуноглобулины Yптиц, рептилий и двоякодышащих рыб - функциональные аналоги IgGмлекопитающих. Так же, как и IgG, молекулы IgYсостоят из двух тяжелых и двух легких цепей. Основные отличия связаны с тяжелыми цепями. Тяжелая цепь немного больше чем у IgG, а легкая, наоборот, меньше. В отличии от IgG, IgYне связываются с белками А и G, с клеточными рецепторами Fcи не активируют систему комплемента. В высокой концентрации накапливаются в яичном желтке.

• 
  Слайд 17
  

  Практическое использование IgYимеет ряд преимуществ по сравнению с IgG: Неинвазивный способ получения материала для выделения IgY(желток отложенных яиц), Более низкое перекрестное реагирование с белками млекопитающих по сравнению с IgG, Более высокий иммунный ответ на ряд антигенов, В желтке накапливаются исключительно IgY (IgAи IgMотсутствуют) При этом, содержание IgYв желтке сравнимо с таковым для IgGв сыворотке крови млекопитающих. Недостатки: В случае IgG можно напрямую использовать сыворотку, IgY необходимо очистить. Более сложные способы очистки (не способность связываться с белками А или G).

• 
  Слайд 18
  

  Трансгенная курица - константные домены IgYзаменены на аналогичные области IgGчеловека.

  Удобный источник иммуноглобулинов, Более простой способ их очистки, Возможность использования иммуноглобулинов на человеке.

• 
  Слайд 19

  Гены иммуноглобулиновмлекопитающих

  Легкие цепи (IgL) - группы сцепления для к- и А-типов Тяжелыецепи (IgH) - группа сцепления одного типа Каждая группа сцепления имеет V-гены и С-гены Легкиецепи к-типа - три группы генов: 1) 250 Vk-генов, 2) 5 J-мини-генов 3) Один Ск-ген кодирует константный домен легкой к-цепи.

• 
  Слайд 20
  

  Вариабельные V-домены тяжелых цепей (IgH) кодируются тремя генными сегментами: V (более 500 генов), D (15 генов)и J (4 гена). Константные области тяжелых цепей кодируются несколькими С-генами. У человека10 С-генов, у мышей 8. Различные C-гены ответственны за кодирование классов и подклассов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgD, IgE, IgM).

• 
  Слайд 21

  Гены IgYкурицы

  Константная С-область тяжелой цепи IgG человека содержит 3тандемных домена CH1, CH2, CH3, Константная С-область тяжелой цепи IgY курицысодержит 4 тандемных домена CH1, CH2, CH3, CH4 ДоменыCH1иCH2IgYкурицыкодируются одним экзоном. Домены CH3 и CH4 IgY курицыимеют высокую гомологию с доменами CH2иCH3IgGчеловека.

• 
  Слайд 22
  

  Стратегия получения трансгенной курицы, производящей химерные IgY/IgG антитела.

• 
  Слайд 23
  

  Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки - основа получения трансгенных мышей и других млекопитающих. У курицы ЭС клетки развиваются только в соматические линии клеток, не могут давать половые клетки. Однако выделенные из эмбрионов курицы примордиальные клетки (primordialgermcells, PGCs) можно культивировать в среде, проводить их трансфекцию чужеродной ДНК с последующей селекцией, имплантировать их назад в эмбрион, где они могут заселять развивающиеся гонады и приводить к получению истинных трансгенных куриц в следующем поколении. Примордиальные клетки выделяют из крови мужских эмбрионов на стадиях 13-15 (Hamburger-Hamilton), культивируют, трансфицируют и вводят в кровоток реципиентным эмбрионам на тех же стадиях - 13-15.

• 
  Слайд 24
  

  Immunoglobulin knockout chickens via efficient homologous recombination in primordial germ cells. Schusser et al., Proc NatlAcadSci U S A. 2013, 110(50): 20170–20175.

  Primordial germ cells were derived from blood collected at stages 13–15 (Hamburger-Hamilton) from a male embryo and cultured in KO-DMEM containing 40% (vol/vol) Buffalo rat liver (BRL) cell conditioned medium, 7.5% (vol/vol) FBS, 2.5% (vol/vol) chicken serum, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvate, 1× nonessential amino acids, and 0.1 mM β-mercapto-ethanol and supplemented with 6 ng/mL recombinant mouse stem cell factor and 4 ng/mL recombinant human fibroblast growth factor basic (R&D Systems) on a feeder layer of irradiated BRL cells. 5 × 106 cells were suspended in 100 µl of AmaxaV buffer with 20 µg linearized DNA and transfected as previously described. Each transfection was plated on a full 48w plate. Puromycin selection (0.5 µg/mL) was started 3–5 d after transfection. Puromycin-resistant clones were expanded for genotyping and injection. Recipient embryos were incubated until stages 13–15 (Hamburger-Hamilton) and transferred to a collection dish. After injection of 3,000 JH-KO PGCs into the vasculature, the embryos were transferred to a surrogate shell and incubated until hatch.

• 
  Слайд 25